Effizientere Gentechnik dank neuer CRISPR-Cas9-Varianten

Wissenschaftler der Medizinische Hochschule Hannover (MHH) haben drei Varianten des CRISPR-Cas9-Systems verbessert – für eine gezieltere und wirksamere biomedizinische Anwendung.

Das CRISPR/Cas-System, umgangssprachlich auch als Genschere bekannt, kann gezielt DNA schneiden und verändern. In der Forschung können damit fehlerhafte Gene repariert und entfernt oder neue Gene eingefügt werden. Dabei gibt es verschiedene Varianten der Genschere, die jeweils ganz bestimmte Stellen im Genom ansteuern. Aber nicht alle sind gleichermaßen effizient.

Ein Forschungsteam um Prof. Tobias Cantz und Dr. Reto Eggenschwiler aus der Klinik für Gastroenterologie, Hepatologie, Infektiologie und Endokrinologie der MHH hat nun einen Weg gefunden, drei Genscheren-Varianten zu „schärfen“ und ihre Wirksamkeit zu erhöhen. Die Ergebnisse der Studie sind kürzlich in der Fachzeitschrift „Nucleic Acids Research“ veröffentlicht worden.

Ursprung: bakterielle Virenabwehr

Ursprünglich handelt es sich beim CRISPR-System um eine biologische Abwehr, mit der sich Bakterien gegen eine Infektion mit Phagen wehren. Die fremde DNA wird dabei von der Genschere zerstört, was die Vermehrung der Phagen verhindert. Verschiedene Bakterien besitzen verschiedene Arten und Unterarten dieser CRISPR-Systeme. Eingesetzt wird überwiegend das CRISPR/Cas9-System aus dem Bakterium Streptococcus pyogenes, das beim Menschen unter anderem Scharlach verursachen kann.

Mithilfe einer Guide-RNA wird das Cas9 Enzym an eine bestimmte Stelle der DNA geführt, wo dieses einen Doppelstrangbruch verursacht. An dieser Stelle können dann gezielte genetische Veränderungen vorgenommen werden. Die Reparaturmechanismen der Zelle fügen den Doppelstrang später wieder zusammen. Damit Cas9 aktiv werden kann, benötigt es ein spezifisches DNA-Erkennungsmotiv, eine sogenannte PAM-Sequenz (Protospacer-Adjacent Motif).

Cas9-Varianten schneiden an anderen DNA-Stellen

Die PAM-Sequenz wird vom Cas9-Enzym benötigt, um die direkt benachbarte Stelle im Genom aufzuschneiden. Diese Sequenz legt also die genauen Bereiche fest, die von der Genschere bearbeitet werden können. Die gängige PAM-Sequenz des CRISPR/Cas9-Systems lautet NGGN. Es gibt aber auch Cas9-Varianten, die andere PAM-Sequenzen ansteuern oder sogar weitgehend auf die PAM-Erkennung verzichten können.

Die damit ausgestatteten Genscheren können das Erbgut also an anderen Stellen schneiden als die ursprüngliche Version. Der Nachteil: Sie schneidet weniger effizient als das Standard-CRISPR/Cas9-System. Das Forschungsteam um Eggenschwiler hat nun die Wechselwirkung mit der DNA von drei dieser Cas9-Varianten im Detail untersucht und diese dann gezielt gentechnisch verändert.

„Wir haben zunächst ein Cas9-Enzym namens iSpyMac verbessert, mit dessen Hilfe sich gezielt NAAN-PAMs ansteuern lassen“, sagt Eggenschwiler. „Das ist wichtig, weil ‚AA‘ das häufigste Dinukleotid, also die häufigste Basen-Doppelfolge im menschlichen Genom ist und somit viele neue Möglichkeiten zur Genveränderung eröffnet.“

Mehr Effizienz durch verbesserte Wechselwirkung

Weiteres Potenzial für neue Schnittstellen bietet zudem die Verbesserung der Enzyme Cas9-SpRY und Cas9-SpG. Cas9-SpRY ist ein sogenanntes PAM-loses Enzym, welches im Gegensatz zum Standard-Cas9 keine strenge PAM-Sequenz mehr braucht. Diese Weiterentwicklung ermöglicht es, DNA an beliebigen Stellen zu schneiden und zu verändern.

Ähnliches gilt für Cas9-SpG. Diese Variante steuert das NGNN-PAM an, benötigt also nur ein einziges Guanin-Nukleotid als Erkennungsstelle auf der DNA. Mit beiden Varianten lassen sich Stellen im Genom ansteuern, an denen keine „traditionellen“ NGGN-PAMs zur Verfügung stehen, was die Flexibilität der CRISPR/Cas9-Technologie erheblich erweitert.

„Mit Hilfe von KI-generierten 3D-Modellen und Hochleistungs-Computersimulationen konnten wir die entsprechenden wichtigen strukturellen Bereiche in den Cas9-Varianten identifizieren“, erklärt der Molekularbiologe. „Daraufhin haben wir die Enzyme dann gezielt so verändert, dass ihre Wechselwirkung mit der DNA an manchen Zielstellen bis um das Vierfache gesteigert werden konnte.“ Die so verbesserten Varianten erlauben nun wirksamere genetische Veränderungen über das gesamte Genom hinweg.

Ziel: vererbte Genmutation behandeln

Mit Hilfe dieser neuen Enzyme wollen die Forschenden nun eine vererbte Genmutation reparieren, die den sogenannten Alpha-1-Antitrypsinmangel verursacht. Hierbei handelt es sich um eine Stoffwechselerkrankungn, bei der Lunge und Leber geschädigt werden.

„Wir wollen es schaffen, diese eine fehlerhafte Base gegen die korrekte Variante auszutauschen“, sagt Mika Opitz, wissenschaftlicher Mitarbeiter und Mitautor der Studie. Gelingt dies, wäre das ein weiterer Schritt in Richtung einer dauerhaften Heilung der schweren Erkrankung, die im Endstadium eine Lungen- oder Lebertransplantation erforderlich macht.