MUTE-Seq ermöglicht Nachweis niedrigfrequenter Krebsmutationen

Der Nachweis von zirkulierender Tumor-DNA in Flüssigbiopsien gilt als vielversprechender Ansatz in der Präzisionsonkologie. Mit einer neuen CRISPR-basierten Sequenzierungsmethode können auch extrem geringe Mengen mutierter DNA detektiert werden.

Flüssigbiopsien gewinnen in der Krebsdiagnostik und im Krankheitsmonitoring zunehmend an Bedeutung. Vor allem der Nachweis von zirkulierender Tumor-DNA (ctDNA) in Blutproben hat sich bei verschiedenen Krebsarten bereits etabliert. Allerdings stellen die oft nur sehr geringen Konzentrationen der ctDNA weiterhin eine Herausforderung dar.

Forschende unter der Leitung von Prof. Junseok Hur vom Korea University College of Medicine haben deshalb MUTE-Seq entwickelt, eine hochempfindliche CRISPR-basierte Sequenzierungsmethode. Neben der Detektion extrem niedrigfrequenter Krebsmutationen werden durch MUTE-Seq außerdem Sequenzierungskosten und Hintergrundrauschen reduziert. Die Studie wurde bereits im August in der Fachzeitschrift „Advanced Materials“ publiziert.

Anreicherung von niedrigfrequenter ctDNA

Kernstück dieses Ansatzes ein gentechnisch verändertes, hochpräzises CRISPR-Enzym: FnCas9-AF2. Dieses erkennt und unterscheidet selbst einzelne Basenfehlpaarungen mit außergewöhnlicher Genauigkeit. Zeitgleich gibt es nahezu keine Off-Target-Aktivität. Durch die selektive Spaltung passender Wildtyp-DNA wird so der relative Anteil von ctDNA vor der Sequenzierung erhöht.

Diese Anreicherung ermöglicht, dass sich seltene Varianten vom intrinsischen Rauschen abheben, das die Next-Generation-Sequenzierung (NGS) üblicherweise begrenzt. „Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die MUTE-Seq-Methode erhebliches Potenzial für die Entwicklung von Diagnosepanels zur Erkennung mehrerer niedrigfrequenter ctDNAs hat”, so Hur. Diese könnten Anwendung in Multi-cancer early detection(MCED)-Tests, therapiebegeitenden Diagnostika (CDx) oder im Monitoring der minimalen Resterkrankung (MRD) finden.

Multiplex-Modus deckt mehrere Krebs-Hotspots ab

In Leistungsbewertungen mittels Sanger-Sequenzierung und NGS erhöhte MUTE-Seq die Allelfrequenzen von Varianten um das bis zu Zehnfache. Dadurch konnte das Team auch Mutationen mit einer Häufigkeit von circa 0,005% nachweisen, die üblicherweise durch die Fehlerrate herkömmlicher Sequenzierungsverfahren verdeckt werden. Bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) identifizierten sie mit der Methode die MRD durch die Verstärkung schwacher, normalerweise nicht nachweisbarer NRAS-Mutationssignale.

Darüber hinaus wendeten die Forschenden MUTE-Seq im Multiplex-Modus auf mehrere klinisch relevante Krebs-Hotspots wie EGFR und KRAS an. Das verbesserte die Übereinstimmung zwischen Plasma und Tumorgewebe bei Patienten mit nicht kleinzelligem Lungenkrebs und Pankreaskrebs, einschließlich Fällen im Frühstadium mit extrem niedrigen ctDNA-Werten.

Potenzielles Werkzeug für die Präzisionsonkologie

Zusätzliche Validierungsstudien mit zellfreien DNA-Referenzmaterialien zeigten eine deutliche Steigerung der Sensitivität – um das Zwanzig- bis Sechzigfache – bei gleichzeitig hoher Spezifität. Die Probit-Analyse ergab eine Nachweisgrenze für die Variantenallelfrequenz von 0,034%, bei der Verwendung von 50 Nanogramm Ausgangs-DNA. Das komme den theoretischen Erwartungen auf Basis von Poisson-Verteilungsmodellen sehr nahe. „Selbst verschwindend geringe Mengen mutierter ctDNA können mit MUTE-Seq nachgewiesen werden, sofern sie in Blutproben vorhanden sind“, schlussfolgert Hur.

Diese Ergebnisse unterstreichen das breite Potenzial von MUTE-Seq zur Optimierung des Nutzens von Flüssigbiopsien. Die Rauschunterdrückung durch Entfernung der Wildtyp-DNA vor der Sequenzierung lässt sich nach Aussage der Autoren mit oder ohne eindeutige molekulare Identifikatoren (UMI) in Standardabläufe integrieren. MUTE-Seq sei dementsprechend ein skalierbares und klinisch anpassbares Werkzeug für die Präzisionsonkologie.

(mkl/BIERMANN)