Neue Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechnik übertrifft die Konkurrenz

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) hat die Medizin und Biologie bereits revolutioniert, indem es die Möglichkeit bietet, das Innenleben von Tausenden von Zellen auf einmal zu untersuchen. Japanische Wissenschaftler stellten jetzt eine neue Technik vor.

Bereits bekannte scRNA-seq-Methoden sind durch potenzielle Ungenauigkeiten bei der Bestimmung der Zellzusammensetzung und ineffiziente komplementäre DNA (cDNA)-Amplifikation begrenzt. Ein Forschungsteam aus Japan hat daher unter der Leitung von Prof. Shigeyuki Shichino und Prof. Kouji Matsushima von der Tokyo University of Science eine neue und verbesserte Technik der scRNA-seq entwickelt. Die neue Methode, Terminator-unterstützte Festphasen-cDNA-Amplifikation und -Sequenzierung (TAS-Seq) genannt, verwendet dazu einfache Materialien und Geräte, um genauere scRNA-Seq-Daten zu liefern. „Unsere Methode TAS-Seq kombiniert genetische Erkennungsempfindlichkeit, Robustheit der Reaktionseffizienz und Genauigkeit der zellulären Zusammensetzung, damit wir wichtige zelluläre Informationen erfassen können“, sagt Shichino. Die Studie wurde am 27. Juni 2022 in Communications Biology veröffentlicht. Zum Forschungsteam gehörten auch Prof. Satoshi Ueha von der Tokyo University of Science, Prof. Taka-aki Sato von der University of Tsukuba und Prof. Shinichi Hashimoto von der Wakayama Medical University.

TAS-Seq verwendet im Detail ein matrizenunabhängiges Enzym für die cDNA-Amplifikation namens Terminal Transferase (TdT). TdT ist allerdings schwierig zu handhaben. Um diese Herausforderung zu bewältigen, fügte das Forschungsteam deshalb Didesoxynukleotidphosphat (ddNTP) als „Terminator“ für die cDNA-Amplifikationsreaktion hinzu. „ddNTPs, insbesondere Didesoxycytidinphosphat (ddCTP), stoppen die übermäßige Verlängerung des Poly-N-Schwanzes durch TdT auf stochastische Weise und reduzieren die technischen Schwierigkeiten der TdT-Reaktion erheblich“, erklärt Shichino. TAS-Seq verwendet zudem eine nanowell/bead-basierte scRNA-seq-Plattform, die die Isolierung einzelner Zellen in Gewebeproben ermöglicht, wodurch Verzerrungen bei der Zellprobenahme verringert und die Genauigkeit der Daten zur Zellzusammensetzung verbessert werden. Das Forschungsteam verifizierte dann die Effizienz von TAS-Seq und verglich es unter Verwendung von murinen und menschlichen Lungengewebeproben mit den aktuellen, weit verbreiteten scRNA-Seq-Techniken, 10X Chromium V2 und Smart-seq2.

Sie fanden heraus, dass TAS-Seq im Vergleich zu den großen scRNA-seq-Plattformen nicht nur insgesamt mehr Gene erkennt, sondern auch besser variable Gene identifizieren konnte. Shichino sagt: „Wir haben festgestellt, dass TAS-Seq 10X Chromium V2 und Smart-seq2 in Bezug auf die Empfindlichkeit der Generkennung und Gen-Drop-out-Raten übertreffen kann, was darauf hindeutet, dass TAS-Seq eines der empfindlichsten Hochdurchsatz-scRNA-Methoden sein könnte. Wir können außerdem über ein breites Spektrum an Expressionsniveaus Gene einheitlicher und Wachstumsfaktor- und Interleukin-Gene robuster nachweisen.“

Ein zusätzlicher Vorteil der neuen Methode soll sein, dass TAS-Seq weniger anfällig für Batch-Effekte ist. Die TAS-Seq-Daten korrelierten zudem stark mit durchflusszytometrischen Daten der Gewebeproben, was darauf hindeutet, dass damit hochgenaue Daten zur Zellzusammensetzung generiert werden können. In Bezug auf die Zukunft verrät Shichino: „Wir haben die Entwicklung von TAS-Seq2 bereits abgeschlossen, einer verbesserten, umfassend optimierten Version von TAS-Seq. TAS-Seq2 hat eine 1,5- bis 2-mal empfindlichere Generkennung in Milzzellen von Mäusen.“ Das Forschungsteam hat außerdem ImmunoGenetics, ein Venture-Unternehmen der Tokyo University of Science, gegründet, um scRNA-seq-Lösungen unter Verwendung von TAS-Seq und TAS-Seq2 anzubieten.

Die Studienautoren fassen zusammen, dass scRNA-seq ein wichtiges Werkzeug für medizinische und biologische Forschund sein kann. Die Entwicklung von TAS-Seq und TAS-Seq2 könnte ihnen zufolge außerdem zur Entdeckung neuer therapeutischer Ziele für Krankheiten und zu Fortschritten auf dem Gebiet der „räumlichen Transkriptomik“ führen, die ebenfalls auf der Festphasen-cDNA-Synthese beruht. Die Methode könnte auch die Entwicklung der Single-Cell-Omics-Technologie beschleunigen und dadurch unser Verständnis der Prinzipien der Biologie sowie der Entwicklung und des Fortschreitens von Krankheiten fördern.