Studie: Wie RNA-bindende Proteine reguliert werden

Die Mechanik des Herzens hängt nicht zuletzt von einem RNA-bindenden Protein namens RBM20 ab. Doch wie werden solche RNA-bindende Proteine reguliert? Ein Team vom Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft (MDC) um Prof. Matthias Selbach hat nun entsprechende Phosphorylierungsstellen identifiziert.

Im Rahmen der Proteinbiosynthese sind zwei Schritte von wesentlicher Bedeutung: Die Transkription – die Übersetzung von DNA in RNA – und die Translation – also das Ablesen der RNA zur Bildung von Proteinen. Doch auch zwischen diesen Prozessen existieren relevante Regulationsmechanismen. „Die Forschung hat sich lange stark auf die […] Transkriptionsfaktoren konzentriert. Also darauf, wie die unmittelbare Bildung der RNAs kontrolliert wird. Aber das ist nur Schritt eins der Genexpression. Auch was danach kommt – die posttranskriptionale Regulation – ist ein sehr wichtiger Prozess“, erklärt Selbach, Leiter der Arbeitsgruppe Proteom-Dynamik am Berliner Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft (MDC) und Letztautor einer Studie, die jetzt in der Fachzeitschrift „Molecular Cell“ erschienen ist.

In der posttranskriptionalen Regulation spielen RNA-bindende Proteine eine wichtige Rolle, um die es in der Studie geht. Bei der Translation außerhalb des Zellkerns, im umgebenden Zytoplasma, dient die RNA – jetzt in Form von Boten-RNA – den Ribosomen als Bauplan für den Aufbau von Proteinen aus Aminosäuren. RNA-bindende Proteine sorgen dafür, dass die Boten-RNA aus dem Zellkern transportiert wird, zum Ribosom gelotst, sich stabilisiert und wieder abgebaut werden kann, wenn sie nicht mehr vonnöten ist.

Anders als bei Transkriptionsfaktoren weiß man allerdings erst wenig darüber, wie die rund 1900 RNA-bindenden Proteine reguliert sind. Meist sind es chemische Modifikationen, die die Funktionen von Proteinen verändern – so können gezielt Phosphatgruppen an einzelnen Aminosäuren angehängt werden (Phosphorylierung). Dadurch ändert sich in der Regel die Aktivität des Proteins.

Wichtig für die Titin-Synthese

In den vergangenen Jahren wurden mehr als 100.000 solcher Phosphorylierungsstellen an Proteinen gefunden. „Doch bei den allermeisten weiß man nicht, was die Phosphatgruppen funktionell bewirken“, sagt Selbach. Zeit also, sich die RNA-bindenden Proteine einmal ganz genau anzusehen. Insbesondere das am MDC intensiv untersuchte RBM20, ein RNA-bindender „Masterregulator“. Er spielt bei der Bildung des variantenreichen, elastischen Proteins Titin im Herzmuskel und damit z.B. bei der Entstehung von Herzmuskel-Erkrankungen eine entscheidende Rolle. Dr. Carlos Henrique Vieira e Viera, Erstautor der Studie, verwendete dazu die am MDC von Prof. Markus Landthaler entwickelte RNA-Interactom-Erfassung – kurz RIC – und erweiterte sie zu einer quantitativen Methode (qRIC).

Normalerweise sind Proteine während ihres Zusammenspiels mit der RNA durch schwache Kräfte wie elektrostatische Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen verbunden. „Durch UV-Licht frieren wir quasi diesen Zustand der Zelle ein – und erst dann schließen wir sie auf“, erklärt Selbach. Dazu werden lebende Zellen mit UV-Licht bestrahlt. Alle Proteine in den Zellen, die gerade sehr dicht an RNA-Molekülen sitzen, werden dadurch stabil an diese gebunden (Crosslinking).

Mehr als hundertmal fündig

Anschließend werden die RNAs samt der an sie gebundenden Proteine herausgefischt, gereinigt und aufgetrennt. Im Massenspektrometer werden die Moleküle ionisiert und zerfallen in charakteristische Bruchstücke. Und darüber können die Forschenden nun auch rekonstruieren, an welchen Stellen der Aminosäurekette der RNA-bindenden Proteine Phosphatgruppen sitzen. Quantitativ wird die Methode, indem man den prozentualen Anteil der phosphorylierten mit den entsprechenden freien Proteinen (ohne Phosphatgruppen) vergleicht.

„Mit dieser quantitativen Methode haben wir über 100 Phosphorylierungsstellen mit regulatorischem Potenzial an verschiedenen RNA-bindenden Proteinen entdeckt. Darunter haben wir auch solche wiedergefunden, von denen bereits bekannt ist, dass sie regulieren“, sagt Vieira e Viera. Dass Phosphatgruppen an diesen Proteinen tatsächlich regulatorische Effekte haben, wiesen die Forschenden in Kooperation mit dem RBM20-Experten Prof. Michael Gotthardt nach, der ebenfalls am MDC arbeitet. Sie brachten RBM20-Mutationen in Zellkulturzellen ein, die entweder an bestimmten Stellen nicht phoshoryliert werden konnten oder statt Phosphat andere chemische Gruppen trugen.

Alternatives Spleißen gestört

Das Resultat: bei RBM20-Mutanten war das alternative Spleißen gestört. Diesen raffinierten Trick der Natur reguliert RBM20. Er erlaubt, dass ein einzelnes Gen den Bauplan für viele Varianten eines Proteins liefert – in diesem Fall des Titins, das für das Herz so wichtig ist. „Die Experimente mit den Mutanten waren für mich ein Wendepunkt. Ich war überrascht, wie eindeutig die Ergebnisse sind. Denn in der Regel kann bei solchen Experimenten viel schief gehen“, betont Vieira e Viera.

„Wir haben demnach Phosphorylierungsstellen identifiziert, die tatsächlich die Regulation von RBM20 beeinflussen“, erläutert Selbach. „Es ist der erste Hinweis darauf, dass diese Stellen funktionell wichtig sind. Ob es für den Herzmuskel oder dessen krankhafte Veränderungen wie bei Kardiomyopathien entscheidend ist, können wir aber noch nicht sagen.“

Bei der qRIC-Methode scheint es sich aus Sicht der Forschenden jedenfalls um die ideale Ergänzung zu routinemäßigen Proteom-Analysen zu handeln. Denn diese erfassen zwar die Gesamtheit der möglichen Modifikationen von Proteinen, die durch Phosphorylierungen entstehen. Sie können aber keinen Einblick in deren mögliche Funktion geben.