Sylite: Visualisierung inhibitorischer Synapsen in Neuronen und Hirngewebe

Forscher vom Rudolf-Virchow-Zentrum (RVZ) der Universität Würzburg haben eine synthetische Affinitätssonde entwickelt. Diese “Sylite” genannte Sonde ermöglicht sowohl die volumetrische Visualisierung von Synapsen in der Weitwinkel- und konfokalen 3-D-Mikroskopie als auch die Kartierung inhibitorischer neuronaler Schaltkreise im Hirngewebe.

Vladimir Khayenko und Noah Nordblom aus der Forschungsgruppe von Dr. Hans Michael Maric am RVZ haben die neue Sonde Sylite entwickelt: eine kompakte peptidbasierte Sonde zur Visualisierung von inhibitorischen Synapsen in Neuronen und Gehirngewebe. Sylite ist eine aktivitätsbasierte Sonde, die Antikörper hinsichtlich Selektivität, Einfachheit und Vielseitigkeit übertrifft. Die Entwicklung von Sylite und ihre Anwendung in der konventionellen und superauflösenden Mikroskopie sowie in Studien auf Zell- und Schaltkreisebene wurde nun in der Peer-Review-Fachzeitschrift “Angewandte Chemie” veröffentlicht.

Visualisierung von Synapsen und aktuelle Einschränkungen
Inhibitorische Synapsen im zentralen Nervensystem sind entweder glycinerg oder GABAerg und werden in der Regel mittels Gephyrin identifiziert und visualisiert. Dieser Marker fungiert als Gerüstprotein, das hemmende Rezeptoren an der Postsynapse stabilisiert. Die Anzahl der Gephyrinproteine bestimmt somit die Anzahl an Rezeptoren und korreliert daher auch mit der neuronalen Signalstärke.
Die Visualisierung hemmender Synapsen kann durch eine genetische Markierung erreicht werden, was jedoch aufwändig ist und ungewollte morphologische sowie funktionelle Änderungen hervorrufen kann. Ein alternativer Ansatz ist die Immunfärbung von Gephyrin, die allerdings eine spezielle Anpassung des Färbeprotokolls an die jeweiligen Probentypen und Bildgebungsverfahren erfordert und insbesondere in Gewebeanwendungen, durch die begrenzte Eindringtiefe der dabei verwendeten Antikörper, problematisch ist.

Sylite enthüllt die Ultrastruktur hemmender Synapsen und die Vernetzung des Gehirns
“Ausgehend von einem endogenen Liganden von Gephyrin, entwickelten wir einen kurzen peptidbasierten Binder und dimerisierten ihn, wodurch wir, ähnlich wie es bei Antikörpern der Fall ist, die Selektivität deutlich erhöhen konnten. Die Sonde mit den besten Eigenschaften nannten wir Sylite“, berichtet Maric.

Sylite zielt auf rezeptorbindende Gephyrin-Isoformen ab, das heißt auf Isoformen, die in Neuronen eine funktionelle Rolle spielen. Khayenko bestätigte im Labor von Dr. Christian Specht vom Institut national de la santé et de la recherche médicale in Paris nicht nur eine lineare Korrelation der Sondenmarkierung mit neuronalem Gephyrin, sondern beobachtete sogar eine Verbesserung gegenüber den Anti-Gephyrin-Antikörpern, welche momentan als Goldstandard gelten. Zusammen machten sie die Synapse auch mit hochauflösender Mikroskopie sichtbar.
„Von den herausragenden Sylite-Färbungen in der Zellkultur motiviert wollte ich das Potenzial der Sonde in der Bildgebung von Geweben erforschen, da hier die geringe Größe das Eindringen in das Gewebe erleichtern sollte”, so Khayenko.

Aus diesem Grund wandte sich das Team an Prof. Philip Tovote und dessen Studentin Sara Reis vom Institut für Klinische Neurobiologie der Universität Würzburg. Gemeinsam führten sie mehrere Färbungen von Hirngewebe durch, wobei Sylite die Gephyrin-Antikörper in jeder Hinsicht übertraf. Es traten keine Färbungsartefakte auf und die Sonde durchdrang 50 μm dicke Hirnschnitte innerhalb von nur einer Stunde. Die getesteten Antikörper hingegen, verursachten insbesondere bei längeren Einwirkdauern Fehlfärbungen und erreichten selbst nach 24 Stunden nur teilweise ihre Zielproteine. Zudem demonstrierte die Forschergruppe das Potenzial von Sylite, indem sie die Sonde einsetzte, um die synaptische Vernetzung im Mittelhirn zusammen mit genauen Synapsengrößen zu bestimmen.

Künftige Anwendungen und Verfügbarkeit von Syliten
„Ich arbeite derzeit an Sylite-Derivaten, die es uns ermöglichen werden, hemmende Postsynapsen sichtbar zu machen und die Modulation der hemmenden Signalübertragung in lebenden Zellen zu erforschen”, berichtet Khayenko, und Maric resümiert: „Kompakte synthetische Sonden wie Sylite eröffnen neue Forschungsmöglichkeiten in den Neurowissenschaften, da sie eine bessere Lokalisierungspräzision und Auflösung ermöglichen und weil sie die Bildgebung im Gewebe erleichtern”.

Publikation:
Khayenko V et al. A Versatile Synthetic Affinity Probe Reveals Inhibitory Synapse Ultrastructure and Brain Connectivity. Angewandte Chemie Int Ed 2022 Apr 14.
doi: 10.1002/anie.202202078