Gen-Knockdown könnte Genomeditierung in Retinazellen erleichtern

Eine Forschungsgruppe aus den USA hat zwei Gene identifiziert, deren Hemmung die Effizienz nichtviraler Genomeditierung deutlich steigern könnte.

In Zellen des retinalen Pigmentepithels von Patienten mit Leberscher kongenitaler Amaurose habe sich dadurch die krankheitsverursachende Mutation wesentlich effizienter korrigieren lassen. Das berichten die Studienautoren in der Fachzeitschrift „Nature Communications“.

Ein wesentliches Hindernis der nichtviralen Genomeditierung ist der Weg des Geneditors zu seinem Wirkort. Lipidnanopartikel können Geneditoren beziehungsweise deren Bauanleitung zwar in die Zelle transportieren. Doch nur ein kleiner Teil ihrer Fracht gelangt bis an den Zellkern.

Screening-Plattform ermöglichte effiziente Gen-für-Gen-Analyse

Prof. Krishanu Saha vom Department of Biomedical Engineering der University of Wisconsin-Madison, Madison, USA, und sein Team erforschen, wie sich dieser Prozess verbessern lässt. Er leitet das CRISPR Vision Program, dessen Ziel es ist, nichtvirale Genomeditierungsverfahren zur Behandlung erblicher Augenerkrankungen einzusetzen.

Dafür haben sieeine Screening-Plattform entwickelt, mit der sie untersuchen konnten, welche zellulären Gene die Effizienz nichtviraler Genomeditierung beeinflussen. Sie schalteten alle 19.114 Gene des menschlichen Genoms einzeln aus und prüften anschließend, ob sich dadurch die Editierung mit CRISPR-Cas9 verbessert.

„Im Grunde schalten wir in verschiedenen Zellen jedes Gen einzeln aus. Würde man das beispielsweise in 19.144 verschiedenen Zellkulturen durchführen, wäre das ein enormer Aufwand“, erklärt Saha. „Hier machen wir das im Wesentlichen in wenigen Kulturschalen mit insgesamt 100 Millionen Zellen. Anschließend ermitteln wir mit einer präzisen Sequenzierungsstrategie, welche Gene die größte Rolle spielen.“

Diese zwei Gene störten die Editierung am stärksten

Aus zunächst 26 Kandidatengenen identifizierten die Forschenden sechs Gene, deren Ausschaltung die Effizienz der nichtviralen Genomeditierung reproduzierbar erhöhte. Als besonders relevant erwiesen sich GJB2 und BET1L.

Für die weitere Validierung wechselten die Forschenden von der klassischen CRISPR-Cas9-Genschere zu Baseneditoren. Während Cas9 einen Doppelstrangbruch der DNA erzeugt, verändern Baseneditoren gezielt einzelne DNA-Basen, ohne die DNA vollständig zu durchtrennen.

Das eignete sich besonders für die untersuchte Form der Leberschen kongenitalen Amaurose (LCA). Die LCA16 wird in dem verwendeten Modell durch die Nonsense-Mutation W53X im KCNJ13-Gen verursacht. Mit dem Adenin-Baseneditor ABE8e konnten die Forschenden die zugrunde liegende Punktmutation gezielt korrigieren.

Lebersche kongenitale Amaurose: Effizienz der Genomeditierung stieg deutlich

Besonders relevant für die Ophthalmologie waren Versuche an patientenabgeleiteten Zellen des retinalen Pigmentepithels (RPE-Zellen) mit der für LCA16 verantwortlichen KCNJ13-W53X-Mutation. Ohne Knockdown wurden 5,8 Prozent der mutierten Sequenzen korrigiert. Nach Knockdown von BET1L stieg die Korrektureffizienz auf 20,9 Prozent, nach Knockdown von GJB2 auf 46,6 Prozent – eine 3,6- beziehungsweise achtfache Steigerung.

Die genetische Korrektur zeigte auch funktionelle Folgen. In editierten Zellen wurde wieder vollständiges Kir7.1-Protein exprimiert und korrekt an der apikalen Membran lokalisiert. Elektrophysiologische Untersuchungen zeigten zudem in einem Teil der Zellen eine Wiederherstellung der Kir7.1-Ionenkanalfunktion.

Der genaue Mechanismus ist noch offen

Wie GJB2 und BET1L die intrazelluläre Verfügbarkeit von Geneditoren genau beeinflussen, ist bislang nicht vollständig geklärt. Aber Experimente, bei denen Cas9 mittels Elektroporation direkt in die Zellen eingebracht und damit die Aufnahme über die Zellmembran umgangen wurde, lieferten Hinweise: Unter diesen Bedingungen verschwand der Vorteil der meisten Knockdowns. Die Ergebnisse sprechen dafür, dass die Gene vor allem Aufnahme und intrazellulären Transport der Editoren beeinflussen.

Die übrigen im Screening identifizierten Gene könnten für andere Zelltypen und Erkrankungen relevant sein. Nach Ansicht der Autoren könnte das Verfahren daher nicht nur zur Verbesserung der Genomeditierung beitragen. Es könnte möglicherweise auch die Verabreichung anderer in Lipidnanopartikeln transportierter Wirkstoffe optimieren – etwa mRNA-Krebsimpfstoffe oder CAR-T-Zelltherapien.

„Ich hoffe, dass andere Forschende diese Methodik aufgreifen und damit untersuchen, welche zellulären Mechanismen und Signalwege für die Verabreichung praktisch aller Wirkstoffe wichtig sind, die sich in Lipidnanopartikel verpacken lassen“, erklärt Saha. „Insofern könnten die Auswirkungen weit über die Genomeditierung hinausgehen.“

(ak/BIERMANN)