Neue Einzelzell-Technologie erfasst RNA und Proteine gleichzeitig

US-Forschende haben mit CIPHER-seq eine neuartige Einzelzell-Technologie entwickelt, die RNA und Proteine in einzelnen Immunzellen gleichzeitig erfasst. Dazu zählen nicht nur Oberflächenproteine, sondern erstmals auch intrazelluläre Proteine und Zytokine.

Forschende der University of Miami (USA) haben mit CIPHER-seq eine neue Einzelzell-Technologie entwickelt, die das Transkriptom, Oberflächenproteine und intrazelluläre Zytokine einer einzelnen Zelle gleichzeitig erfasst. Die Methode soll ein genaueres Bild der Immunantwort liefern als bisherige Verfahren. Langfristig könnte sie so zur Entwicklung verbesserter Immuntherapien beitragen. Die Ergebnisse wurden in der Fachzeitschrift „Scientific Reports“ veröffentlicht.

RNA- und Proteindaten stimmen häufig nicht überein

Die Analyse einzelner Immunzellen mittels Single-Cell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) hat die immunologische Forschung in den vergangenen Jahren wesentlich vorangebracht. Allerdings spiegeln Transkriptomdaten nicht zwangsläufig die tatsächliche Proteinproduktion einer Zelle wider. Besonders bei Zytokinen stimmen Transkriptom- und Proteindaten häufig nur unzureichend überein.

„RNA liefert Hinweise darauf, in welche Richtung sich eine Zelle entwickelt“, sagt Justin Taylor vom Sylvester Comprehensive Cancer Center, Co-Seniorautor der Studie. „Proteine zeigen hingegen, wo sie tatsächlich ankommt.“

Das belegen er und sein Forschungsteam eindrücklich anhand zweier Beispiele: Die statistische Auswertung einer groß angelegten Brustkrebskohorte und des etablierten SPARC-Datensatzes zeigt, dass die globalen Spearman-Korrelationskoeffizienten zwischen RNA- und Proteinkonzentrationen auf Einzelzellebene eher niedrig ausfallen (ρ = 0.28 bzw. ρ = 0.12).

Momentaufnahme einer Zelle – auf vier Ebenen

„Bei Immunzellen steigen und fallen RNA- und Proteinspiegel nicht zwangsläufig synchron“, erklärt Co-Seniorautor Emiliano Cocco die Beobachtungen. Im Gegenteil: Der zeitliche Ablauf der Zytokinproduktion unterliegt strengen biologischen Kontrollmechanismen. Dazu zählen eine Reihe von post-transkriptionellen Prozessen wie beispielsweise der miRNA-gesteuerte mRNA-Abbau.

Eine gesteigerte Transkriptionsrate äußert sich somit nicht automatisch in einer größeren Proteinmenge. Diese Diskrepanz wird mittels scRNA-seq allerdings nicht erfasst. Die etwas fortgeschrittenere Methode CITE-seq ermöglicht zwar, RNA-Transkripte und Oberflächenproteine gleichzeitig zu erfassen; intrazelluläre Proteine und Zytokine bleiben jedoch ebenso außen vor.

Genau hier setzen die Forschenden mit ihrer neuen Methode an. CIPHER-seq („Cytokine Intracellular Protein High-throughput Expression with RNA sequencing“) ermöglicht die gleichzeitige Erfassung von Informationen auf vier Ebenen – innerhalb derselben Zelle. Dazu gehören:

• genomweite RNA-Expression (Whole-Transcriptome)
• Oberflächenproteine
• intrazelluläre Proteine
• intrazelluläre Zytokine vor der Sekretion

Dadurch entsteht eine multimodale Momentaufnahme der Immunaktivität. Außerdem ermöglicht das Multiplexing die gleichzeitige Analyse mehrerer Proben. Für das Barcoding kommen einzigartige RNA-Sonden und antikörperkonjugierte Oligonukleotide (ADT) zum Einsatz, ähnlich wie bei CITE-seq.

Weniger Zellstress als etablierte Verfahren

Der bedeutende Vorteil von CIPHER-seq besteht nach Angaben der Autor:innen in der schonenderen Probenverarbeitung. Hierfür testeten die Forschenden eine Auswahl von intrazellulären Färbeprotokollen am Beispiel des Proteins Tubulin.

Im Vergleich zu etablierten Protokollen verursacht CIPHER-seq deutlich weniger zellulären Stress. Die neue Methode punktet insbesondere mit einer Reduktion der mitochondrialen Stresssignale. Die Ausbeute an Immunzellen blieb währenddessen vergleichbar mit anderen Verfahren, bei gleichzeitig überlegener RNA-Qualität.

Die Knackpunkte der Probenverarbeitung liegen dabei in der Fixierung und Permeabilisierung. Hier sieht das CIPHER-seq-Protokoll zum einen die Nutzung optimierter Reagenzien vor, die die Zellstruktur erhalten. Des weiteren werden während des gesamten Vorgangs RNase-Inhibitoren eingesetzt.

Zum anderen optimierten die Forschenden neben der Dauer auch die Temperatur der Inkubationen. Durch kürzere Inkubationszeiten bei 4°C oder auf Eis werden die Zellen den aggressiven Puffern somit weniger stark ausgesetzt.

Zeitliche Dynamik der Zytokinantwort

„Wir wollten eine Methode schaffen, die die Zellen so wenig wie möglich von ihrem natürlichen Zustand entfernt“, erklärt Taylor. Doch ist dem wirklich so? Gemeint ist der schonendere Prozess der Fixierung/Permeabilisierung. Zur Validierung der Methode wurden die untersuchten Zellen (PBMCs) jedoch zunächst mit PMA/Ionomycin stimuliert und anschließend mit Brefeldin A behandelt.

Mittels CIPHER-seq erfassten die Forschenden zuverlässig die Induktion wichtiger Zytokine wie Interferon-γ (INF-γ) und Tumornekrosefaktor (TNF). Eine zeitliche Rekonstruktion der Zellaktivierung visualisiert zudem die Dynamik der Zytokinproduktion. Das Ergebnis: Die entsprechenden RNA-Signale gingen dem Proteinanstieg konsequent voraus – die zeitliche Verzögerung war zwar minimal, aber konsistent.

Durch die physiologische Manipulation der Zellen, insbesondere der Zytokinsekretion, handelt es sich allerdings dennoch nicht um die Momentaufnahme einer natürlich agierenden Zelle. Die Analyse der Dynamik unter in vivo Bedingungen bleibt somit weiter eine Herausforderung.

Wie zuverlässig sind Einzelzell-Transkriptomdaten?

Trotzdem stellt CIPHER-seq ein bemerkenswertes und innovatives Verfahren dar. Mit ihm adressieren die Autor:innen ein aktuelles Kernproblem sowohl in der Grundlagen- als auch translationalen Forschung, nämlich die Frage nach der Verlässlichkeit von Transkriptomdaten ohne ergänzende Proteomdaten. Erstere sind inzwischen vielfach die Grundlage für die Entwicklung von Immuntherapien oder die Risikostratifizierung von Patient:innen.

Nach Einschätzung der Autor:innen eröffnet CIPHER-seq hier nun neue Möglichkeiten, beispielsweise für die Untersuchung von Tumorimmunität, Entzündungsprozessen und Therapieresistenzen. Durch die kombinierte Analyse von RNA- und Proteinebene könne die Dynamik von Immunreaktionen künftig präziser charakterisiert werden als mit transkriptombasierten Verfahren allein.

Ob und wie schnell sich CIPHER-seq in weiteren Laboren etablieren lässt, ist allerdings eine andere Frage. Die Autor:innen betonen, dass das Protokoll kommerziell erhältliche Reagenzien verwende und mit verfügbaren Sequenziergeräten kompatibel sei. Weitere potenzielle Kostenfaktoren sind die Synthese der ADTs, die einen hochspezifischen Antikörperklon und dessen individuelle Validierung erfordert, und erforderliche Sequenziertiefen bei schwach exprimierten Zytokinen.

(mkl/BIERMANN)